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全基因表達譜芯片

  • 簡介
  • 芯片特點
  • 實驗流程
  • 結果展示
  • 客戶實例
  • SCI成果
  •        全基因組基因表達譜的檢測對疾病研究有非常重要的意義。一方面,基因表達譜的檢測可以應用于疾病生物標記物的篩選。另一方面,基因表達譜的檢測可以為基因功能研究提供線索,有助于揭示疾病發生發展的分子機制。

    Aksomics(康成生物)為您提供全基因組表達譜芯片技術服務,您只需要提供保存完好的組織或細胞標本,Aksomics的芯片技術服務人員就可為您完成全部實驗操作,并提供完整的實驗報告。同時,根據您的研究需要,Aksomics還提供基因網絡關系分析、分子標志物篩選分析等數據挖掘服務。

    Agilent表達譜芯片產品列表

    芯片名稱 種屬 規格 基因數 Database Source
    Whole human genome 4 x 44K ~41,000 Goldenpath, Ensembl, Unigene, Human Genome (Build 33), Refseq, GebBank
    whole mouse genome 小鼠 4 x 44K ~41,000 USC mRNA known genes, Natl. Institute on Aging, Genbank, Unigene, Refseq, Ensembl, RIKEN
    whole rat genome 大鼠 4 x 44K ~41,000 Ensembl, UCSC Goldenpath, Unigene, Refseq, Genbank
    SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K v2 Microarray 8 x 60 K ~50,000 RefSeq, Ensemble, Unigene, GenBank, Broad Institute Human lincRNA and TUCP catalog
    SurePrint G3 Mouse GE 8x60K Microarray 小鼠 8 x 60 K ~40,000 RefSeq, Ensembl, Unigene, GenBank, RIKEN
    SurePrint G3 Rat GE 8x60K Microarray 大鼠 8 x 60 K ~30,000 RefSeq, Ensembl,Unigene, GenBank

    Agilent還提供多類物種的表達譜芯片
    動物:兔、豬、斑馬魚、果蠅等           植物:水稻、玉米、擬南芥、煙草等           
    微生物:大腸桿菌、酵母等

  • ● 原位噴墨合成技術:原位合成的探針使得芯片平臺具有極高的穩定性,噴墨合成技術可以大規模、靈活地合成探針,為客戶提供最新的芯片設計。

    ● 60mer的長探針:與短探針相比,具有更高的信噪比、靈敏度和特異性。

    ● 權威公認:2006年美國FDA發表的主流芯片平臺評估報告MAQC中,Agilent array的C-V值、檢測基因數目、與Taqman探針的重復性均處于國際同行業領先水平。

  • 1. 樣品RNA抽提:
           a. 實驗對象為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,使用BioPulverizerTM冰凍粉碎組織,加1ml的RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen),使用Mini- Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA
           b. 實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細胞,加1ml的RNA抽提試劑TRIzol(樣品為貼壁細胞,每10cm2培養皿TRIzol使用量為1ml),裂解后抽提RNA
    2. RNA質量檢測:
           a. 使用Nanodrop測定RNA在分光光度計260nm、280nm和230nm的吸收值,以計算濃度并評估純度
           b. 用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度及完整性
           c. 提供RNA QC報告
           注意:用于芯片檢測的RNA樣品,必須是高質量的,完整的,沒有RNase污染(降解的樣品不能用于標記和芯片檢測),沒有基因組污染。
    3. cDNA/aRNA樣品合成和標記
    4. 標記效率質量檢測:
           使用Nanodrop檢測熒光標記效率,標記效率合格以保證后續芯片實驗結果的可靠性
    5. 芯片雜交:
           在標準條件下將標記好的探針和高密度基因組芯片進行雜交
    6. 圖像采集和數據分析:
           使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度,并將實驗結果轉換成數字型數據保存,使用配套軟件對原始數據進行分析運算
    7. 提供實驗報告 包括詳細的實驗方法以及芯片實驗數據和圖表,以雙色標記實驗為例:
           Scanning Image: Cy3、Cy5熒光掃描圖像
           Scatter Plot: 散點圖,X軸為Control(Cy3)數據值,Y軸為Exp(Cy5)數據值,表示芯片上兩通道數據總體分布集中趨勢;
           MA-plot: MA圖,X軸為A值[log2(Exp)+log2(Control)]/2,代表點的整體信號強度,Y軸為M值log2(Exp)-log2(Control)表示點的兩通道信號差,可由MA圖觀察芯片數據是否存在強度依賴的系統偏移以及信號差異點的比例
           Raw Data: 探針的掃描熒光信號強度原始數據
           Normalized Ratio: 原始數據經過統計學方法標準化后的比值的對數,log2(Exp/ Control)
           p –value: T-test統計分析顯著差異表達的基因,p-value越小,該基因在兩樣本間差異表達越顯著
           Significant Up & Down Regulated Gene List: 給出Fold Change>=2,p-value<0.05的基因列表



  • 1.差異基因篩選
           對于每個實驗組有三次以上生物學重復的實驗設計,我們應用T檢驗篩選任意兩個實驗組之間差異表達的基因。方差分析(ANOVA)則用于從三個以上實驗組篩選差異表達的基因。Aksomics除了提供常規的通過p值篩選的差異基因,還提供通過FDR篩選的差異基因。與p值篩選相比,FDR篩選對多重篩選過程中的假陽性率進行控制,是一種更加嚴謹的篩選方法。

           適用范圍:一般用于兩組或多組實驗狀態下的比較,建議每組實驗至少有3次生物學重復。

     
    一般篩選標準:Fold Change>=2,p-Value<=0.05


     2.聚類分析
           為了全面而直觀地展示樣品之間的關系及基因表達差異情況,將表達基因做層次聚類分析。用挑選的基因的表達情況來計算樣品直接的相關性。一般來說,同一類樣品能通過聚類出現在同一個簇(Cluster)中,聚在同一個簇的基因可能具有類似的生物學功能。 

           適用范圍:兩組或多組樣品的表達譜數據


     


    3.GO分析

           Gene Ontology(簡稱GO)是基因功能國際標準分類體系。GO可分為分子功能(Molecular Function),生物過程(Biological Process)和細胞組成(Cellular Component)三個部分。GO-Analysis對差異基因等按GO分類,并對分類結果進 行基于離散分布的顯著性分析、誤判率分析、富集度分析,得出與實驗目的有顯著聯系的、低誤判率的、靶向性的基因功能分類,該分類即導致樣本性狀差異的最重要的功能差別。通過該分析有可能找到導致性狀變化的重要功能,并且找到該功能所對應的基因。

           適用范圍:兩組或多組數據比較獲得的差異基因

      


    4.Pathway分析

           信號通路(Pathway)是多個基因間相互作用,共同調節細胞功能和代謝活動的過程。而信號通路分析是通過對差異基因按照Pathway的主要公共數據庫KEGG來進行分類,得到與實驗目的有顯著聯系的Pathway類別。

           適用范圍:兩組或多組數據比較獲得的差異基因

     


    高級數據分析展示

    1. 趨勢分析(STEM-Analysis)

           從芯片數據中挑選出一群隨時間或濃度顯著性變化的基因,并同時給出相應的統計檢驗值來幫助我們篩選具有顯著性的基因群體。

           適用范圍:實驗設計為隨時間或濃度梯度變化的實驗分組數據,并且時間點或濃度梯度不超過8個。

     


    2. 基因間相互作用網絡分析

           通常在表達譜芯片分析后會得到大量的差異表達基因。我們利用主流的幾個蛋白相互作用數據庫(BIOGRID, INTACT, MINT, DIP, BIND, HPRD)的數據,來獲取這些差異表達基因之間,或差異表達基因與其它相關聯基因之間蛋白-蛋白相互作用網絡,進而得到在網絡中處于核心地位的關鍵基因。

           適用范圍:兩組或多組數據比較獲得的差異基因,用于分析的基因數目一般情況下應小于100個。

     


    聯合分析

    (1)mRNA表達譜& miRNA表達譜聯合分析

           根據表達譜芯片結果和miRNA芯片結果聯合分析,進一步定位差異miRNA發揮功能的途徑以及相應的差異表達靶基因可能引起的生物學通路變化。首先利用差異表達的miRNA找尋靶基因,將其與表達譜中的差異表達基因取交集。這樣能找到既是差異miRNA的靶基因又在表達譜芯片中差異表達的基因,可以進一步縮小miRNA可能影響的基因的范圍,能夠更加準確地研究這些基因所發揮的生物學功能。

           適用范圍:同時具有mRNA表達譜數據和miRNA表達譜數據的樣品,一般情況下用于分析的差異miRNA數目應小于10

     

    *圖釋:其中方塊節點為miRNA,圓形節點為gene。箭頭表示預測的靶向關系。紅色的點是芯片中上調的節點,綠色的點是芯片中下調的節點。節點的大小與邊的多少成正相關。邊越多節點越大。


    (2)mRNA表達譜&甲基化數據聯合分析

           幫助客戶找尋典型的甲基化調控基因:典型情況是找尋mRNA表達上調且對應Promoter區域甲基化程度減少的基因,在聯合分析基礎上可以展示甲基化與mRNA層面的相關性,找到與甲基化負相關的mRNA。mRNA表達下調且對應Promoter區域甲基化程度增加的基因羅列成表格形式。

           適用范圍:同時具有mRNA表達譜和甲基化譜的樣品




  • 1.生物標記物案例

    乳腺癌預后生物標記物篩選(Van't Veer L J. et al. Nature, 2002. Van De Vijver M J. et al. New England Journal of Medicine, 2002)

           乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,原發性乳腺癌患者往往會有不同的預后,而傳統的方法(淋巴結狀態、組織學分級)不能作出準確預測。為了解決這個問題,作者使用特定基因表達特征預測原發性乳腺癌的預后。使用Agilent表達譜芯片對98例原發性乳腺癌患者進行檢測,5000個基因表達水平發生顯著變化。通過生物信息學手段:回歸分析和置換檢驗,發現其中70個差異表達基因能夠有效區分預后好和預后差的原發性乳腺癌患者。進一步,在295例原發性乳腺癌病例樣本中進行驗證,這70個基因的表達特征能夠很好地預測原發性乳腺癌患者的預后。值得一提的是,2007年,基于該70個基因的表達譜芯片獲得FDA認證,用于原發性乳腺癌患者的臨床預后。


    技術路線

     


    結果展示

     

    *圖釋:左圖A:每一行代表一個原發性乳腺癌標本,每一列代表一個基因。每一個點代表單個基因在單個樣本中的表達水平。虛線代表區分預后的閾值線。B:紅點代表5年內發生乳腺癌轉移的病例(預后差),藍點代表5年內未出現乳腺癌轉移病例的隨訪時間。右圖:Kaplan–Meier分析,基于70個基因的表達特征區分的預后好和預后差乳腺癌患者未發生腫瘤轉移的可能性。預后好的病例未發生腫瘤轉移的概率明顯高于預后差的病例。


    2.功能機制研究案例

    表達譜芯片用于糖尿病引發的前列腺病變的分子機制研究(Ye C. et al. Laboratory Investigation, 2011)

           糖尿病是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損導致的以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病會影響前列腺上皮細胞增殖、分化和死亡,引發前列腺炎,嚴重地可能會導致前列腺癌。但是,糖尿病引起前列腺病變的分子機制仍不清楚。

    為了研究這個問題,作者構建了STZ(鏈脲霉素)誘導的大鼠糖尿病模型。使用表達譜芯片分析糖尿病大鼠和正常大鼠的前列腺組織,組間比較發現2304個基因的表達水平發生顯著變化。差異基因根據功能可歸類為:DNA損傷修復、細胞循環檢測、細胞增殖和細胞凋亡等。選擇參與上述過程的13個基因進行PCR驗證,與DNA損傷修復相關的基因MRE11和XRCC3在糖尿病大鼠前列腺組織中顯著下調,這與芯片結果一致。通過免疫組化實驗,


    技術路線

     

    結果展示

     


    *圖釋:左圖:差異表達基因顯著富集的生物學過程及其中的差異表達基因數目。

  • → TRIB3 Promotes APL Progression through Stabilization of the Oncoprotein PML-RARα and Inhibition of p53-Mediated Senescence. Cancer Cell. 2017

    → Loss of Gsα impairs liver regeneration through a defect in the crosstalk between cAMP and growth factor signaling. J Hepatol. 2016

    → Phosphorylation of glutaminase by PKCε is essential for its enzymatic activity and critically contributes to tumorigenesis. Cell Research. 2018

    → The bioactivity of D-/L-isonucleoside-and 2’-deoxyinosine-incorporated aptamer AS1411s and their regulation of DNA replication and miRNA expression. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2017

    → FOXP3 promotes tumor growth and metastasis by activating Wnt/β-catenin signaling pathway and EMT in non-small cell lung cancer. Molecular Cancer. 2017

    → Long noncoding RNA CRNDE stabilized by hnRNPUL2 accelerates cell proliferation and migration in colorectal carcinoma via activating Ras/MAPK signaling pathways. Cell Death & Disease. 2017

    → In vitro expansion impaired the stemness of early passage mesenchymal stem cells for treatment of cartilage defects. Cell Death & Disease. 2017

    → PMP22 Regulates Self-Renewal and Chemoresistance of Gastric Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 2017

    → Increased Variability of Genomic Transcription in Schizophrenia. Scientific Reports. 2016

    → Altered expression of mRNA profiles in blood of early-onset schizophrenia. Scientific Reports. 2016

    → Kindlin-2 promotes hepatocellular carcinoma invasion and metastasis by increasing Wnt/β-catenin signaling. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2017

    → Competing endogenous RNA expression profiling in pre-eclampsia identifies hsa_circ_0036877 as a potential novel blood biomarker for early pre-eclampsia. Clinical epigenetics. 2018

    → The Antimuscarinic Agent Tolterodine Regulates Bladder Extracellular Matrix in Partial Bladder Outlet Obstruction in Rats.Cellular Physiology and Biochemistry. 2018

    → Differential Expression of MiR-106b-5p and MiR-200c-3p in Newly Diagnosed Versus Chronic Primary Immune Thrombocytopenia Patients Based on Systematic Analysis. Cellular Physiology and Biochemistry. 2018

    → ABCF2, an Nrf2 target gene, contributes to cisplatin resistance in ovarian cancer cells. Molecular Carcinogenesis. 2017