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tRF&tiRNA實時定量PCR

  • 簡介
  • 服務流程
  •        實時熒光定量PCR技術是在普通PCR反應體系中加入熒光試劑,利用熒光信號實時檢測PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一、靈敏、快速、高重復性地精確定量起始模板濃度。tRF & tiRNA是由tRNA切割產生,長度約15-45個核苷酸的小RNA。由于tRF & tiRNA長度太短,且與tRNA序列完全重疊,不能通過傳統的實時定量PCR進行檢測。本公司通過在tRF & tiRNA兩端引入人工合成序列(adaptor),設計特殊的跨連接位點的定量PCR引物,可以精確檢測微量樣品中tRF & tiRNA表達水平。

    Aksomics(康成生物)為您提供tRF&tiRNA 實時定量PCR技術服務,您只需提供保存完好的組織或者細胞標本,本公司專業的技術服務人員就可替您完成tRF&tiRNA實時定量PCR實驗操作和數據分析,提供給您完整的實驗報告,為您節省大量的時間和精力。

     

    圖1. 雙端接頭法保證了tRF & tiRNA PCR產物的高特異性。

  • 1. 引物設計、合成
           設計并合成目的tRF & tiRNA的特異性PCR引物。
     2. 樣品RNA抽提
           a. 若實驗對象為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),勻漿后抽提RNA。
           b. 若實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細胞,完全吸去培養液后加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。
     3. RNA質量檢測
           a. 紫外吸收測定法測定RNA在波長260nm和280nm的吸收值,獲得RNA的濃度并通過A260/280及A260/230的吸收比值判斷RNA的純度。
           b. 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。
           注:用于tRF & tiRNA實時定量PCR檢測的RNA樣品,必須高純度、完整,沒有RNase 污染(降解的樣品不能用于實時定量PCR檢測),同時提取方法必須保證所得樣品包含完整的小RNA部分。
     4.RNA預處理(可選)
           使用rtStar? tRF&tiRNA Pretreatment Kit (Cat# AS-FS-005, Arraystar)進行預處理,去除3’氨酰基末端與3‘環磷酸末端,磷酸化5’羥基末端,并移去m1A, m3C等多種甲基化修飾。
           注:tRNA上存在大量的轉錄后修飾,而且tRNA需與氨基酸形成氨酰基tRNA方可參與蛋白翻譯。當tRNAs被切割為tRFs&tiRNAs時,這些修飾(包括甲基化修飾、氨酰基末端修飾)會全部或部分的保留下來。tiRNAs常由RNA內切酶Angiogenin切割產生,這類內切酶會在切割位點產生5‘羥基(5’-OH)末端與3’環磷酸(3‘-cP)末端。然而,5’端與3‘端的接頭連接步驟,需要底物小RNA 5’ 端為磷酸,3‘端為羥基。此外,某些tRFs&tiRNAs的內部修飾比如m1A, m1G與m3C會嚴重阻礙反轉錄過程。因此為了準確檢測tRFs&tiRNAs,這些修飾必須被有效的去除。

    5. 逆轉錄合成cDNA
           使用rtStar? First-Strand cDNA Synthesis Kit (3’ and 5’ adaptor) (Cat# AS-FS-003, Arraystar) 試劑盒進行接頭連接和反轉,合成cDNA第一鏈。
     6. 實時定量PCR
           以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增,梯度稀釋的標準同時進行實時定量PCR擴增,根據Ct值制備標準曲線。以同樣的方法測定每個樣品中的內參,校正上樣誤差。
     7. 分析結果、提供實驗報告
           分析實時定量PCR結果,根據標準曲線定量樣品中的目的tRF & tiRNA。提供實驗報告,包括詳細的實驗方法,實時定量PCR實驗數據和圖表。