三分排列3

SAB功能分類PCR芯片

  • 簡介
  • 服務特點
  • 實驗流程
  • 結果展示
  • 客戶實例
  • SCI成果
  •        功能分類基因芯片是生物學通路研究的重要工具。這種芯片將微列陣技術與特定生物學通路(specific biological pathways)的最新知識有機結合,可以大大縮短發現診治各種疾病的生物學標志物(biomarkers)的時間。芯片上的基因包括了那些與研究對象有確定關系的基因,或至少是與研究對象的關系有待考證的基因。如果研究對象是某一生物學通路的基因,則使用針對該類基因的功能分類基因芯片比使用高密度表達譜芯片更加有效便利。
           美國SABiosciences公司(原SuperArray公司)設計了超過100種功能分類芯片,涵蓋生命科學研究的各個領域,在國際上處于領先地位。 其開發的第二代功能分類基因芯片(Real-time PCR芯片),可在一次實驗中準確檢測上百個基因的mRNA水平,并且將檢測精度提高到與實時定量PCR相當的水平。功能分類PCR芯片:靈敏度高,樣品的使用量低,每張芯片使用的總RNA最少可為0.5ng;可觀察到的動態線性范圍超過105,可以同時檢測表達量差異較大的基因;重復性高,Ct值的平均差異只有0.25個循環;分辨率高,可檢測超過兩倍的基因表達量變化;特異性好,PCR擴增產物條帶單一。SABiosciences公司設計了超過100種功能分類PCR芯片,涵蓋生命科學研究的各個領域。
           SABioscienses還提供芯片定制服務(Custom PCR Arrays)。定制PCR芯片是根據不同研究需要量身定做的PCR芯片。定制PCR芯片被廣泛應用于基因表達譜結果驗證及特定信號通路的研究等。同時,它還特別適合于大樣本的生物學標記物研究,無論這些生物學標志物是來自于研究者的前期研究成果、各種文獻報道、還是表達譜芯片篩選的結果,SABiosciences都能夠靈活設計出符合需要的定制PCR芯片,獲得高精確性、高靈敏度,高重復性的實驗結果,縮短生物學標志物篩選的進程。

    Aksomics(康成生物)為您提供SABiosciences公司第二代功能分類基因芯片——實時定量PCR芯片技術服務,全部實驗皆使用進口試劑完成,使用的定量PCR儀器為美國應用生物系統公司生產的熒光定量PCR儀ABI PRISM? 7700或ABI PRISM? 7900。PCR芯片技術服務的主要流程包括:RNA抽提、RNA質量檢測、cDNA模板制備、實時定量PCR、數據處理及制作實驗報告。

  • 靈敏度高:樣品的使用量低,每張芯片使用的總RNA最少可為0.5ng;
    動態線性范圍超過105可以同時檢測表達量差異較大的基因;
    重復性高:Ct值的平均差異只有0.25個循環;
    分辨率高:可檢測超過兩倍的基因表達量變化;
    特異性好:PCR擴增產物條帶單一。
    數據全面、可靠:芯片包含的基因來自公共權威數據庫、權威綜述和相關文獻挖掘
    覆蓋度高:SABiosciences公司設計了超過200種功能分類PCR芯片,涵蓋生命科學研究的各個領域(詳見列表)。
    對照全面:5個管家基因,1個基因組DNA對照(GDC),3個反轉錄對照(RTC)和3個PCR對照(PPC)

  • 1.樣品RNA抽提
           a. 實驗對象為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,使用BioPulverizerTM冰凍粉碎組織,加1ml的RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen),使用Mini- Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。
           b. 實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細胞,加1ml的RNA抽提試劑TRIzol(樣品為貼壁細胞,每10cm2培養皿TRIzol使用量為1ml),裂解后抽提RNA。
    2.DNase I消化RNA樣品
           DNase I在370C溫育處理RNA樣品,去除RNA抽提過程中可能混入的的基因組DNA。
    3.RNA純化
           RNeasy? MinElute?純化試劑盒(Qiagen)對DNase I處理的RNA樣品純化回收,已得到單純的RNA樣本。
    4.RNA質量檢測
           a) 使用Nanodrop測定RNA在分光光度計260nm、280nm和230nm的吸收值,以計算濃度并評估純度。
           b) 用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度及完整性。
           c)  提供RNA QC報告。
    5.cDNA合成
           按照逆轉錄酶(Invitrogen或Promega)使用說明將樣品RNA逆轉錄為cDNA (根據樣品RNA質量選用oligo dT或隨機引物)。
    6.實時定量PCR
           按照芯片說明將cDNA模板適當稀釋后加入到實時定量PCR反應混合液中,然后再含有基因特異性引物的96孔板各孔中加入等量反應液,進行實時定量PCR反應。
    7.數據分析
           利用配套軟件計算PCR芯片中的各個基因的Ct值,采用公認的DDCt方法比較基因的表達變化。
           a. 計算每個處理組中的每個通路相關基因的ΔCt。
           ΔCt(Ctrl) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Ctrl array
           ΔCt (Exp) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Exp array
           b. 計算2個PCR Array中每個基因的ΔΔCt。
           ΔΔCt = ΔCt (Exp) - ΔCt (Ctrl)
           c. 通過2-ΔΔCt計算Exp(實驗組)與Ctrl(對照組)間基因的表達差異。
    8.提供實驗報告
           Gene table(96孔板個基因列表)
           Excel芯片結果匯總表(包括芯片原始結果、數據分析和各種圖表)



  • 1.基因表達數據列表
           表達有差異(>2倍)或有顯著性(P<0.05)的數據用有顏色的字體標注,客戶可以很方便的根據自身要求,利用倍數變化或P值在列表中篩選靶基因。

    *圖釋:表達倍數大于2倍,或p值小于0.05的數據用帶顏色的字體標注。客戶可以根據自身要求利用倍數變化或P值篩選靶基因


    2.散點圖

           客戶可以根據三點圖直觀的看到表達上下調的基因,及其上下調程度

    *圖釋:位于灰色條帶上方的是上調倍數大于2倍的基因,位于灰色條帶下方的是下調倍數大于2倍的基因


    3.3D

           可以直觀的了解表達上下調的基因,及其在PCR板上的位置

    *圖釋:縱軸為基因表達倍數變化,橫縱軸分別代表相應基因在PCR板上的位置。







  • 1.功能分類PCR芯片揭示CENP-A調控肝癌的分子機制

    ShRNA-Targeted Centromere Protein A Inhibits Hepatocellular Carcinoma Growth.PLOS ONE, 2012) 

           CENP-A是一個保守的著絲粒蛋白,在癌癥中高表達,是惡性腫瘤的“Hallmark”。在肝癌組織中,CENP-A的mRNA水平和蛋白水平明顯高于癌旁組織。RNAi和過表達實驗顯示CENP-A能夠促進細胞從GO/G1期進入S期,從而促進細胞增殖,抑制細胞凋亡。但是CENP-A調控細胞周期的分子機制仍不清楚。

           為了揭示CENP-A調控細胞周期的分子機制,作者使用Human Cell Cycle PCR芯片檢測92個與細胞周期相關的基因表達水平。相對于對照肝癌細胞,在CENP-A RNAi的肝癌細胞中,3個基因顯著上調,17個基因顯著下調。3個上調基因與細胞周期負調控有關,而下調顯著的基因與細胞周期進程密切相關。在上述相同的細胞中,通過western blot檢測5個顯著差異基因的蛋白水平變化,其變化趨勢與mRNA變化趨勢一致。從而揭示了CENP-A通過調控與細胞周期有關基因的表達從而調控肝癌細胞增殖和凋亡的分子機制。

    技術路線



    結果展示

    *圖釋:CENP-A RNAi導致的細胞周期相關的差異表達基因



    2.功能分類PCR芯片揭示EIF5A2促進結腸癌轉移的分子機制

    Ovreexpression of EIF5A2 promotes colorectal carcinoma cell aggressiveness by upregulating MTA1 through C-myc to induce epithelialemesenchymal transition.Gut.2011
           EIF5A2是一個重要的抑癌基因,其在結腸癌組織中表達水平明顯升高,并且高水平EIF5A2結腸癌患者預后較差。通過RNAi和過表達實驗,EIF5A2能夠促進腫瘤細胞侵襲和轉移,并且能夠促進結腸癌細胞上皮間質轉化。但是EIF5A2影響結腸癌的分子機制仍不清楚。

           為了揭示EIF5A2促進腫瘤細胞侵襲和轉移的分子機制,作者使用human tumour metastasis PCR芯片檢測與腫瘤轉移相關的84個基因的表達水平。比較EIF5A2過表達的結腸癌細胞和對照結腸癌細胞發現:過表達EIF5A2顯著上調MMP2, IGF1, METAP2 和 MTA1,顯著下調NR4A3 和 CTNNA1。Western blot檢測差異表達基因,其中在過表達EIF5A2的結腸癌細胞中,MTA1蛋白水平明顯上升,CTNNA1蛋白水平明顯下降。免疫組化顯示MTA1與EIF5A2表達水平密切相關。進一步作者通過RNAi和過表達實驗,確認MTA1能夠促進腫瘤轉移和上皮間質轉化。ChIP實驗結果顯示,在EIF5A2過表達的結腸癌細胞中,更多c-myc結合在MTA1啟動子區域,從而促進MTA1表達。從而揭示了EI5A2通過上調MTA1促進結腸癌轉移的分子機制。


    技術路線


    結果展示

    *圖釋:Human tumour metastasis RT2 PCR芯片結果列表





  • → Dynamic network biomarker indicates pulmonary metastasis at the tipping point of hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 2018

    → Overexpression of EIF5A2 promotes colorectal carcinoma cell aggressiveness by upregulating MTA1 through C-myc to induce ithelialemesenchymal transition. GUT. 2012

    → Peritumoral neutrophils link inflammatory response to disease progression by fostering angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 2011

    → Water-Soluble Ruthenium(II) Complexes with Chiral 4?(2,3-Dihydroxypropyl)-formamide Oxoaporphine (FOA): In Vitro and in Vivo Anticancer Activity by Stabilization of G?Quadruplex DNA, Inhibition of Telomerase Activity, and Induction of Tumor Cell Apoptosis. Journal of Medicinal Chemistry. 2015

    → The properties of tumor-initiating cells from a hepatocellular carcinoma patient's primary and recurrent tumor. Carcinogenesis. 2010

    → Identification of liver metastasis-related genes in a novel human pancreatic carcinoma cell model by microarray analysis. Cancer Letter. 2009

    → ShRNA-Targeted Centromere Protein A Inhibits Hepatocellular Carcinoma Growth. Plos One. 2011

    → Effect of burn injury on apoptosis and expression of apoptosis-related genes/proteins in skeletal muscles of rats. Apoptosis. 2009

    → Escin attenuates cognitive deficits and hippocampal injury after transient global cerebral ischemia in mice via regulating certain inflammatory genes. Neurochem Int. 2010

    → Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumor Biology. 2014

    → Scutellarin suppresses human colorectal cancer metastasis and angiogenesis by targeting ephrinb2. Am J Transl Res. 2017

    → Rapamycin inhibits pre-B acute lymphoblastic leukemia cells by downregulating DNA and RNA polymerases. Leukemia Research. 2014

    → Gene expression profile towards the prediction of patient survival of gastric cancer. Biomed Pharmacother. 2010

    → Toxoplasma gondii isolate with genotype Chinese 1 triggers trophoblast apoptosis through oxidative stress and mitochondrial dysfunction in mice. Experimental Parasitology. 2015

    → Mitochondrial genome sequencing of chondrocytes in osteoarthritis by Human Mitochondria RT2 Profiler? PCR Array. Molecular Medicine Reports. 2015

    → Effects of chronic mild stress on the development of atherosclerosis and expression of toll-like receptor 4 signaling pathway in adolescent apolipoprotein E knockout mice. J Biomed Biotechnol. 2009