三分排列3

piRNA芯片

  • 簡介
  • 實驗流程
  • SCI成果
  •        piRNA(Piwi-interacting RNA)是從哺乳動物生殖細胞中分離得到的一類非編碼小RNA。成熟的piRNA是一類長約26-32nt的單鏈小RNA分子。在小鼠睪丸內只存在幾百種不同的miRNA,而piRNA卻至少有5萬種。piRNA即使在近緣物種之間保守性也很差,在長度、表達類型和基因結構上則與microRNA截然不同。


    Arraystar piRNA芯片

           Arraystar的科學家已經研制了針對人、小鼠和大鼠的piRNA芯片,可以對piRNA的總體表達情況進行檢測。三個物種的piRNA序列都來自NCBI數據庫,并且使用UCSC Blat技術在HG19, MM9和RN4數據庫中分別進行染色體定位(map)。我們采用恰當的策略來挑選探針,然后使用雙重方法(duplex method)設計60 mer的反義寡核苷酸探針。使用我們專有的piRNA芯片(表1),我們將提供從樣品準備到全面數據分析的綜合服務。


    芯片名稱 物種 數據庫 規格 檢測piRNA數
    Arraystar Human piRNA Array Human HG19 4x44K 23,677
    Arraystar Mouse piRNA Array Mouse MM9 4x44K 43,537
    Arraystar Rat piRNA Array Rat RN4 4×44K 39,727
  • 1.樣品RNA抽提

           a.實驗對象為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,使用BioPulverizerTM冰凍粉碎組織,加1ml的RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen),使用Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。
           b.實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細胞,加1ml RNA抽提試劑TRIzol(樣品為貼壁細胞,每10cm2培養皿TRIzol使用量為1ml),裂解后抽提RNA。

    2. RNA質量檢測

           a.使用Nanodrop測定RNA在分光光度計260nm、280nm和230nm的吸收值,以計算濃度并評估純度。

           b.用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度及完整性。

           c.提供RNA QC報告。

           注意:用于芯片檢測的RNA樣品,必須是高質量的,完整的,沒有RNase污染(降解的樣品不能用于標記和芯片檢測),沒有基因組污染。

    3.制備熒光標記探針

           使用Arraystar標記試劑盒熒光標記piRNA

    4.芯片雜交

           在標準條件下使用雜交儀將標記好的探針和Arraystar piRNA芯片雜交。

    5.圖像采集和數據分析

           使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度,并將實驗結果轉換成數字型數據保存,使用配套軟件對原始數據進行分析運算。

    6.提供實驗報告——包括詳細的實驗方法和芯片實驗數據及圖表

           a.芯片掃描圖

           b.操作說明(含RNA質檢報告)

           c.芯片數據

           數據匯總表格(EXCEL格式,包含探針位置,探針名稱,原始信號值,修正信號值,標準化信號 值,樣品間piRNA表達量的比值)

           差異表達piRNA的數據表格(EXCEL格式,包含表達上調2倍的piRNA和表達下調2倍的piRNA)

           d.進一步數據分析

           Scatter Plot(主要針對單色重復實驗數據進行相關性R值計算)

           分層聚類(進行多個樣品實驗時,按基因表達相似程度進行聚類,從而將多個樣品進行歸類)

           若進行重復實驗(≥3)則計算CV值、p值,并做Volcano Plot

  • → PIWIL3/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA feedback loop regulates the biological behavior of glioma cells. Theranostics. 2018

    → Roles of piRNAs in microcystin-leucine-arginine (MC-LR) induced reproductive toxicity in testis on male offspring.  Food and Chemical Toxicology. 2017