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mRNA實時定量PCR

  • 簡介
  • 實驗流程
  •        實時熒光定量PCR技術即是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR避免了傳統PCR以終產物檢測定量產生的偏差,提高實驗的重復性。該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化、比較不同組織的mRNA表達差異、驗證基因芯片和siRNA干擾的實驗結果。

    Aksomics(康成生物)為您提供的一站式mRNA實時熒光定量PCR技術服務,您只需要提供保存完好的組織或細胞標本,本公司專業的技術服務人員就可替您完成mRNA實時定量PCR實驗操作和數據分析,提供給您完整的實驗報告,為您節省大量的時間和精力。全部實驗皆使用進口試劑完成;定量PCR儀器為美國應用生物系統公司生產的熒光定量PCR儀ABI PRISM 7900、Corbett Research公司生產的離心式實時定量PCR儀Rotor-Gene 3000。

  • 1.設計并合成Realtime PCR引物

    2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進行含SG(SYBR? Green)的PCR反應的優化。

    3. RNA抽提

           a.若實驗對象為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),勻漿后抽提RNA。
           b.若實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細胞,完全吸去培養液后加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。

    4. RNA質量檢測
           a.紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,以計算其濃度并評估RNA純度。
           b.使用甲醛電泳試劑(ambion)進行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度及完整性。

    5. cDNA合成
           按照逆轉錄酶(Invitrogen或Promega)5.使用說明將樣品RNA逆轉錄為cDNA。

    6.制備標準曲線樣品(可選)
           進行相對定量,需要先將樣品的目的基因以及管家基因進行PCR擴增, 其產物進行梯度稀釋用于做標準曲線。

    7.實時定量PCR
           標準曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應液中(其中TaqBead熱啟動聚合酶來自Promega公司),進行RealTime PCR擴增和檢測

    8.數據分析
           檢測結果進行標準曲線分析,以對待測樣品的目的基因進行定量。相對定量實驗需要進一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差,所得結果代表某樣品的目的基因相對含量。

    9.提供實驗報告:

            包括詳細的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結果及相關圖表。