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microRNA測序

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  • SCI成果
  •       microRNA是一類大小為21-23nt的非編碼小RNA分子,通過沉默或降解其靶點mRNA分子調控基因表達。大量研究表明,microRNA在正常發育過程以及疾病發生過程中具有重要的作用,在診斷和治療領域具有光明的應用前景。然而目前研究microRNA的方法主要是通過實時定量PCR以及基因芯片技術,這些方法主要關注microRNA的表達與定量,并僅局限于研究那些序列信息或二級莖環結構信息已知的microRNA,無法尋找和發現新的microRNA分子。基于Illumina高通量測序平臺的microRNA測序技術突破了目前研究技術手段上的局限性,使研究人員能夠直接對樣本中指定大小的所有microRNA分子進行高通量測序,在無需任何序列信息的前提下研究microRNA的表達譜并在此基礎上發現和鑒定新的microRNA分子,并提供了更加靈活和深入的研究分析方法,這是傳統的研究方法所無法比擬的。

    Aksomics(康成生物)為您提供microRNA測序服務,您只需提供保存完好的RNA,細胞或組織樣品,Aksomics的技術人員即可為您完成全部實驗操作,包括文庫構建、高通量測序和數據分析,并提供直接可用的數據報告及Paper級結果圖表。我們的標準報告涵蓋其他服務商沒有或者僅作為可選項的高級分析項目,助力您深入microRNA研究。

  • 1.一站式解決方案

           您只需要提供保存完好的組織或細胞樣本,Aksomics的測序技術服務人員就可為您完成全部實驗操作,并提供完整的實驗報告。

    2. 適合樣品量少的客戶

           測序實驗經過優化,從總RNA開始實驗,不需要對MicroRNA進行富集和反復的純化,因此對于樣品量少的客戶更加適合, 1ug就可以進行實驗。

    3.  節省實驗的步驟,減少實驗誤差

           傳統方法是先對microRNA進行富集,再兩邊加接頭,而且每一步都要純化回收,很容易產生實驗誤差,而我們只需要對總RNA就能完成實驗,減少實驗誤差。

    4.深入的數據分析

           Aksomics擁有強大的生物信息學團隊,能夠根據不同客戶的要求進行標準和深入的數據分析,提供能直接用于文章發表的圖表和數據。



  • 1.樣品RNA準備
    2.測序文庫構建
           PAGE膠純化特定大小的microRNA分子
           連接5’RNA接頭
           連接3’RNA接頭
           逆轉錄反應獲得cDNA測序文庫
           高保真聚合酶擴增構建的測序文庫
    3. DNA成簇(Cluster)擴增
    4.高通量測序(Illumina Genome Analyzer IIx)
    5.數據分析
           原始數據讀取
           使用公用microRNA數據庫注釋已知microRNA
           深層次數據分析
    6.提供實驗報告
           原始數據報告(Fasta-Q格式),包含所有測序序列信息,堿基讀取質量評估
           基本數據分析報告(Excel表格),包含有效序列的序列信息、與參考基因組比對后的注釋信息等
           高級數據分析(應客戶要求定制),如使用已知數據庫注釋已知microRNA及分析不同樣本間表達水平差異,使用已知數據庫鑒別rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA并預測新的microRNA,預測microRNA的靶點基因。

  • miRNA測序基本數據分析結果展示

    1.測序數據統計


    Sample Name

    Clean Reads*

    Adaptor Trimmed**

    microRNA Reads***

    Z381-FCort

    7,237,456

    7,000,106

    5,906,193

    Z381-PCort

    7,483,217

    7,199,637

    5,743,606

    *圖釋:*: 通過Illumina質控的高質量read的數目;**:去掉接頭序列后長度大于或等于15nt的read數目;***:能夠與最新版miRBase數據庫中的pre-microRNA序列匹配(最多允許一個堿基的錯配)的read數目


    2.microRNA表達譜數據

           microRNA測序最常見的用途就是對不同樣品中microRNA的表達進行定量分析和比較。但是由于原始read數與測序數據量相關,直接用原始read值衡量特定microRNA的表達是不合適的。因此,我們對microRNA的表達量進行了標準化:將原始的read值轉化為TPM(在每兆可與miRBase數據庫中的pre-microRNA匹配的reads中,特定microRNA轉錄本所占的read數目)。TPM值可以用于衡量特定microRNA在樣品中的表達豐度,以及對不同樣品間差異表達的microRNA的分析。

    *圖釋:microRNA表達譜數據示例


    3.microRNA差異表達數據

           根據標準化后的microRNA表達值(TPM),我們會計算出每個microRNA在不同樣品間(如處理組 vs 對照組)的表達變化(fold change),并通過ttest計算樣品間microRNA表達量變化的統計學顯著性。那些表達變化倍數在1.5倍以上,p值小于0.05的microRNA被挑選出來,并定義為顯著性差異表達的microRNA。針對多重比較,p值被校正為FDR。客戶可以根據倍數變化,p值,FDR等參數對差異表達的microRNA進行排序和篩選。

    *圖釋:樣品間差異表達的microRNA數據示例


    4.差異表達microRNA的聚類圖

           層次聚類是一種最常見的用于分析表達數據的聚類方法。它可以根據樣品中基因的表達水平將樣品自動的分組,可以讓客戶從整體上評估樣品間的基因表達差異,以及樣品間的關系。左側的樹狀圖可以反映樣品間基因表達模式的關系。


    *圖釋不同樣品組之間差異表達microRNA的聚類示例


    5.差異表達microRNA的火山圖

           火山圖可以對不同樣品組之間差異表達的microRNA進行圖形化的展示。橫軸代表處理組和對照組之間microRNA表達倍數的變化(log2轉化),縱軸代表相應的p值(-log10轉化)。火山圖可以直觀的展示microRNA在樣品組間的倍數變化與相應的統計學顯著性之間的關系(圖5)。縱向的綠線分別對應1.5倍的上調(右側)和下調(左側),綠色平行線對應0.05的p值。下面火山圖中的紅色點代表在不同樣品組中具有統計學顯著性的差異microRNA。

    *圖釋火山圖示例


    6.新的microRNA預測

           通過microRNA測序可以預測新的microRNA。新microRNA能通過miRDeep軟件進行預測。根據microRNA成熟過程中,dicer酶對microRNA前體的加工原理,miRDeep構建了一種簡單的預測模型。通過這個模型,它可以根據高通量測序結果準確的預測樣品中的新microRNA。

    7.差異表達microRNA的靶基因預測及功能富集分析

           它們通過誘導mRNA降解或轉錄抑制在基因表達調控中起著一種重要的作用。每個microRNA通過部分序列互補的方式結合到基因的3'UTR,平均靶向幾百個基因。Aksomics整合了最權威的microRNA靶基因預測算法,研究top10差異miRNA(上下調各10個)的靶基因,并構建microRNA-靶基因調控網絡,以推斷這些microRNA的功能。

    *圖釋上圖:通過靶基因預測構建的差異表達microRNA-靶基因網絡(紅色矩形:microRNA;藍色圓形:靶基因);下圖:預測得到的靶基因的GO富集結果。根據排名前10條的GO-term來展示結果,點顏色代表P-value,點大小代表靶基因和該GO條目中均存在的基因個數。

  • 豬傳染性胃腸病毒感染引起的microRNA轉錄組應答(The Porcine MicroRNA Transcriptome Response to Transmissible Gastroenteritis Virus Infection. PLoS One, 2015)

           TGEV(豬傳染性胃腸病毒)是一種具有高傳染性、具有多種傳播途徑并在全球廣泛分布的病毒,它所引起的豬胃腸系統疾病每年都會給養豬產業帶來巨大的經濟損失。為了揭示病毒感染過程中的的microRNA分子調控機制,作者對TGEV感染實驗組和對照細胞進行了microRNA高通量測序,測序數據比對注釋結果發現了其中存在284個已知microRNA成熟體和241個novel microRNA。隨后的組間比較結果顯示其中已知microRNA中分別出現了15個上調和44下調。從中挑選了10個microRNA進行qPCR驗證,結果證實測序數據與qPCR結果相符。進一步通過生物信息學手段進行分析發現其中4個差異表達microRNA可能會靶作用于TGEV基因組;而對其中包括miR-146b和miR-155-5p在內的幾個差異表達microRNA的靶基因進行功能富集分析,結果顯示這些microRNA可能會通過作用于相應的靶基因來參與對代謝加工、細胞免疫反應、T細胞發育、細胞凋亡和細胞因子產生等過程的調控。該課題研究成果提供了一種全新的應對策略方向來治療和預防TGEV感染。


    結果展示


    *圖釋:microRNA靶位點預測及靶基因功能富集。上圖:ssc-miR-28-3p、ssc-miR-126-5p、ssc-miR-306-5p和ssc-miR-2411在TGEV基因組上預測的結合位點;下圖:差異microRNA預測靶基因的GO注釋結果。



  • → miRNA-3473b contributes to neuroinflammation following cerebral ischemia. Cell death & disease. 2018

    → Involvement of aberrantly activated HOTAIR/EZH2/miR-193a feedback loop in progression of prostate cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2017

    → Circulating microRNA signature for the diagnosis of childhood dilated cardiomyopathy. Scientific reports. 2018

    → High Throughput Sequencing Identifies MicroRNAs Mediating α-Synuclein Toxicity by Targeting Neuroactive-Ligand Receptor Interaction Pathway in Early Stage of Drosophila Parkinson's Disease Model. PLoS One. 2015

    → The Porcine MicroRNA Transcriptome Response to Transmissible Gastroenteritis Virus Infection. PLoS One. 2015

    → Integrated analysis of microRNA and transcription factor reveals important regulators and regulatory motifs in adult B-cell acute lymphoblastic leukemia. International Journal of Oncology. 2017

    → Molecular dysfunctions in acute myeloid leukemia revealed by integrated analysis of microRNA and transcription factor. INT J ONCOL. 2016

    → MicroRNA-34a targets regulator of calcineurin 1 to modulate endothelial inflammation after fetal cardiac bypass in goat placenta. Placenta. 2017

    → MicroRNA expression profile in the third- and fourth-stage larvae of Angiostrongylus cantonensis. Parasitol Res. 2014

    → MicroRNA-30a-5p promotes replication of porcine circovirus type 2 through enhancing autophagy by targeting 14-3-3. Archives of Virology. 2017

    → Differential expression of micrornas in porcine parvovirus infected porcine cell line. Virology Journal. 2015 

    → MicroRNA-146b-5p Identified in Porcine Liver Donation Model is Associated with Early Allograft Dysfunction in Human Liver Transplantation. Medical Science Monitor. 2017



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