三分排列3

microRNA實時定量PCR

  • 簡介
  • 實驗流程
  • 客戶案例
  •        實時熒光定量PCR技術是在普通PCR反應體系中加入熒光試劑,利用熒光信號實時檢測PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一、靈敏、快速、高重復性地精確定量起始模板濃度。成熟microRNA是由21-25個核苷酸組成的小RNA,由于長度太短,不能通過傳統的實時定量PCR進行檢測。本公司通過特殊設計的莖環結構的反轉錄引物,配合實時定量PCR引物及探針可以精確檢測微量樣品中microRNA表達水平,也可以用終點PCR法定性檢測。

    Aksomics(康成生物)為您提供microRNA實時定量PCR技術服務,您只需要提供保存完好的組織或細胞標本,本公司專業的技術服務人員就可替您完成microRNA實時定量PCR實驗操作和數據分析,提供給您完整的實驗報告,為您節省大量的時間和精力。

  • 1. 引物設計、合成

           設計并合成目的microRNA的莖環RT引物、PCR引物和檢測用熒光探針,并合成該microRNA相應的DNA寡核苷酸作為標準。
    2. 樣品RNA抽提
           a.組織樣品:取適量(50~100mg)新鮮組織或正確保存的組織樣品,勻漿后用PURELINKTM試劑抽提RNA。
           b.細胞樣品:取1×106~1×107細胞,PBS清洗細胞,吸去PBS后用PURELINKTM試劑抽提RNA。
    3. RNA質量檢測
           a.紫外吸收測定法測定RNA在波長260nm和280nm的吸收值,獲得RNA的濃度并通過A260/280及A260/230的吸收比值判斷RNA的純度。

           b.甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。
           注:用于microRNA實時定量PCR檢測的RNA樣品,必須高純度、完整,沒有RNase污染(降解的樣品不能用于實時定量PCR檢測),同時提取方法必須保證所得樣品包含完整的小RNA部分。
    4. 逆轉錄合成cDNA    

           利用莖環引物逆轉錄合成cDNA第一鏈。
    5. 實時定量PCR
           以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增,梯度稀釋的標準同時進行實時定量PCR擴增,根據Ct值制備標準曲線。以同樣的方法測定每個樣品中U6 snRNA含量作為內參,校正上樣誤差。
    6. 分析結果、提供實驗報告
           分析實時定量PCR結果,根據標準曲線定量樣品中的目的microRNA。提供實驗報告,包括詳細的實驗方法,實時定量PCR實驗數據和圖表。



  • Signature microRNA Expression Profile of Essential Hypertension and Its Novel Link to Human Cytomegalovirus Infection. Circulation, 2011.
           研究者首先采用Exiqon miRCURY LNA?芯片(v11.0)檢測13例高血壓患者和5例健康人血漿樣本的microRNA表達譜,發現27個表達差異的microRNA。隨后對第二組24例高血壓患者和22例健康人的血漿樣本,應用實時定量PCR方法對芯片篩選出的表達有變化的microRNA進行驗證(見下圖)。PCR結果和芯片結果一致。并進一步在第三組,194例高血壓患者和97例健康人的血漿樣本中應用實時定量PCR方法對挑選出的重要microRNA進行檢測。發現與健康人相比,HCMV編碼的hcmv-miR-UL112在高血壓患者的血漿中表達明顯上調。

    上圖:microRNA qPCR驗證microRNA芯片數據。從microRNA芯片數據挑選了20個差異表達的microRNA,利用熒光定量PCR進行驗證,結果顯示與microRNA芯片得出的表達趨勢基本一致。紅色表示健康人樣本,綠色表示高血壓病人樣本,microRNA的表達量經過snRNA U6歸一化。