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LncRNA實時定量PCR

  • 簡介
  • 實驗流程
  • 客戶案例
  •        LncRNA是目前生命科學以及醫學研究領域中的研究熱點之一。由于LncRNA具有一些重要的分子特征,在進行實時定量PCR檢測的時候需要更為精細的實驗設計:

           可變剪接:大部分的LncRNA在成熟過程中,經過剪接步驟。一些LncRNA在這個過程中形成剪接異構體,這些異構體的表達具有組織特異性,其中部分具有不同甚至相反的生物學功能,因此需要對LncRNA進行轉錄本特異的檢測。

           長鏈反義非編碼RNA(long antisense ncRNA):大約50%的蛋白編碼基因的基因組區域能夠轉錄形成長鏈反義非編碼RNA. 這些RNA分子轉錄方向和蛋白編碼基因相反,沒有蛋白編碼能力,是LncRNA的重要組成部分。 sense轉錄本和antisense轉錄本可能具有不同的生物學功能,然而基于oligo(dT)或隨機引物的標準RT-PCR方法缺乏鏈特異性,不能將兩種轉錄本進行有效區分,得到的數值是兩個轉錄本的總表達量。如圖所示:經過第一輪PCR 反應后,sense轉錄本和antisense轉錄本產生相同的雙鏈DNA產物,下游的PCR 反應無法進行區分。

    *圖釋:  應用oligo (dT) 和隨機引物的RT-PCR反應不具有鏈特異性


    Aksomics(康成生物)為您提供LncRNA實時定量PCR技術服務,通過轉錄本特異性的引物設計以及鏈特異性的RT步驟解決LncRNA PCR檢測中的難點。高效,專一地精確定量樣品中的LncRNA表達量。您只需要提供保存完好的組織或細胞標本,Aksomics專業的技術服務人員就可替您完成LncRNA實時定量PCR實驗操作和數據分析,提供給您完整的實驗報告,為您節省大量的時間和精力。

  • 1. 引物設計、合成及測試

           a. 從權威數據庫(Refseq, UCSC known gene, ensemble, 相關文獻)中得到非編碼RNA的序列,屏蔽SNP及重復序列。

           b. 在引物設計軟件中,調整引物的設計位點,將引物設計在轉錄本特異的區域,如: exon-exon的連接點附近。然后根據PCR的反應條件,優化引物參數,如 Tm值,產物大小,二級結構,引物二聚體等。

           c.  通過和數據庫blast比對,降低引物非特異性擴展的可能性。

           d. 通過實驗對引物的擴增效果進行測試。

    2. 樣品RNA抽提及RNA質量檢測
           a. 紫外吸收測定法測定RNA在波長260nm和280nm的吸收值,獲得RNA的濃度并通過 A260/280及A260/230的吸收比值判斷RNA的純度。
           b. 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。

    3. 逆轉錄合成cDNA
           利用鏈特異性的反轉錄引物進行RT反應,合成cDNA。

    4. 實時定量PCR
           以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增。同時檢測每個樣品中內參基因的表達量,校正上樣誤差。

    5. 分析結果、提供實驗報告
           分析實時定量PCR結果,提供實驗報告,包括詳細的實驗方法,實時定量PCR實驗數據和圖表。

  • 實驗實例-1——LncRNA qPCR 

           Dlx-5/6超保守區域轉錄形成兩個剪接異構體LncRNA: Evf-1和Evf-2. Evf-2能夠和Dlx-2蛋白結合形成穩定的復合物,進而刺激Dlx-5和Dlx-6的表達;而Evf-1功能未知。為了精確檢測這兩個LncRNA,我們在可變剪接位點設計了轉錄本特異的引物。如圖2所示。 


    *圖釋:Evf-1和Evf-2的引物設計。綠色箭頭代表的引物針對Evf-1設計,紫色箭頭代表的引物針對Evf-2設計,紅色的引物位于兩個轉錄本共有的部分是非特異性引物所以不被選用。


    實驗實例-2——LncRNA qPCR 

           BACE1是是阿茲海默癥病理學中的關鍵酶,催化Aβ蛋白形成,在阿茲海默病人的樣品中表達量上升。BACE1基因DNA反義鏈上轉錄形成LncRNA  BACE1-AS. 細胞和活體實驗證明 BACE1-AS具有調控BACE-1 mRNA穩定性的功能,因此能促進BACE-1蛋白的表達。準確檢測BACE1-AS的表達量,是研究該LncRNA分子功能的關鍵。鏈特異性地RT反應,僅將靶標轉錄本(BACE1-AS)反轉錄成cDNA, 排除了反義鏈轉錄本帶來的干擾。

    *圖釋: 在RT步驟中選用鏈特異性地引物,僅檢測BACE1-AS。