三分排列3

Ribo seq

  • 簡介
  • 服務特點
  • 實驗流程
  • 結果展示
  • Ribosome profiling是一種新出現的實驗技術,它結合了高通量測序技術的應用,可以在全基因組水平上監測蛋白質的翻譯水平,給研究細胞內蛋白質的翻譯調控機制帶來了新的可能。

    目前Ribo-seq建庫測序的原理主要是通過對細胞使用翻譯抑制劑,使正在翻譯的核糖體固定在mRNA序列或者起始位點上。裂解細胞后在細胞裂解液中加入RNase,消化不受核糖體保護的mRNA,分離單一核糖體并提取純化核糖體上未被消化的短片段mRNA,進行建庫測序和相應的數據分析。

  • 康成生物丨數譜生物采用優化的建庫方法,利用rRNA remove kit去除非目標RNA, 隨后進行建庫測序,該方法提高了基因的檢出率和數據匹配率。同時,優化的核酸回收步驟也可以最大限度減少實驗過程中RNA的損失。

  • 1 Ribo-seq數據長度統計

       高質量的ribo-seq文庫的讀長分布peaks主要集中在26-34nt左右范圍(峰值最高點對應的RPF長度值隨樣本不同有差異),尤其是真核生物的細胞質核糖體。這里,我們根據測序的mRNA的片段分布來評估實驗富集的效率。


    2 reads gene feature分布圖

    將比對到基因組上的reads在gene feature中的分布情況進行統計,定位區域分為5’UTR,CDS,3’UTR。


    3 Principal Component Analysis 主成分分析

    主成分分析(PCA)是一種無監督特征學習的數據降維算法,通過樣本的表達數據展示數據的分類情況。 利用 PCA 分析可獲得樣本在實驗組和對照組之間的直觀分布情況,從而便于對離群樣本進行檢測和去除,并能找出相似度高的樣本集合。我們采用所有樣本中均數差別(ANOVA)顯著的基因(P value ≤ 0.05)做 PCA 分析,繪制得到 PCA 圖(無重復樣本使用全部 gene 做 PCA 圖)

    PCA 結果展示了樣本間數據的分類情況,每種顏色代表各個分組,每個坐標軸代表一種主成分。


    4 Ribo-seq樣品間相關性分析

    樣品間基因表達水平相關性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標。相關系數越接近1,表明樣品之間表達模式的相似程度越高。若樣品中有生物學重復,通常生物重復相關系數要求較高。

    樣品相關系數Heatmap圖,藍色深淺代表相關性高低。


    5 差異TE(Translation Efficiency翻譯效率)基因聚類分析

    Ribo-C vs Ribo-T 顯著差異TE基因聚類示例。差異表達基因聚類圖。每行代表一個基因,每列代表一個樣本。紅色代表TE上調顯著差異基因,綠色代表TE下調顯著差異基因。

    注:TE的計算需要同時做原樣本的RNA SEQ。

    顯著差異TE基因聚類示例

    6 差異顯著TE基因GO富集分析

    差異表達基因的 GO 富集分析結果(Top 3)


    GO 分析(BP、CC、MF)結果中差異最顯著的前 10 個 GO 條目 bar 圖。按照 p-value 從低到高排列,縱坐標表示 p-value(-log10  轉化)。


    7 差異顯著TE基因KEGG富集分析

    前 5 個差異表達顯著基因的 Pathway 結果

    Benjamini-Hochberg False Discovery Rate (FDR) 校正 p_value