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miRStar? miRNA PCR芯片

  • 簡介
  • 產品優勢
  • 實驗流程
  • 分析流程
  •        美國Arraystar公司是非編碼RNA研究領域的領導者, 近期Arraystar公司發布了創新性的miRStar?癌癥特異性microRNA PCR系統,能夠幫助客戶快速篩選microRNA分子標志物,或是解析microRNA的調控機制和功能。其中,miRStar?癌癥特異性microRNA芯片聚焦于血清Oncomir(癌癥相關的miRNA),是microRNA癌癥分子標志物的篩選利器;而miRStar?癌癥特異性microRNA &靶基因PCR芯片能夠同時檢測癌癥相關的microRNA和它們的靶基因,評估這些microRNA對靶標mRNA的調控活性,從而幫助研究者篩選到癌癥中最為核心的功能microRNA分子,并迅速了解其調控機制和功能。

    Aksomics(康成生物)是Arraystar公司中國地區唯一代理商,獨家為您提供Arraystar公司miRStar? microRNA PCR芯片全程一站式技術服務,您只需要提供保存完好的組織或細胞標本,Aksomics的芯片技術服務人員就可為您完成全部實驗操作,并提供完整的實驗報告。


    miRStar?癌癥特異性microRNA PCR芯片產品列表

    服務

    芯片

    規格

    描述

    miRStar? Human Cancer Focus microRNA PCR Array Service

    Human Cancer Focus microRNA PCR Array

    384-well plate

    184個血清Oncomir

    miRStar? Human Cancer Focus microRNA & Target mRNA PCR Array Service

    Human Cancer Focus microRNA & Target mRNA PCR Array

    384-well plate

    184個癌癥相關的microRNA + 178個靶基因 


    miRStar?癌癥特異性microRNA芯片---聚焦于血清Oncomir,分子標志物篩選利器

           microRNA在癌癥等疾病狀態下發生顯著的表達改變,多年積累的大量研究結果支持microRNA與癌癥的密切關系。近年來,研究進一步發現,microRNA在血清,血漿,尿液等臨床樣品中穩定存在。基于microRNA,特別是血清血漿microRNA 的癌癥分子生物學標記物(biomarker)篩選方興未艾。為了幫助客戶篩選microRNA癌癥分子標志物,Arraystar公司創新性的開發了miRStar?癌癥特異性 microRNA芯片。 miRStar?癌癥特異性 microRNA芯片聚焦于血清血漿Oncomir。它涵蓋了184個從最新的權威數據庫和經典文獻中精心收集的,與胃癌﹑肝癌﹑肺癌﹑乳腺癌﹑卵巢癌﹑結直腸癌﹑胰腺癌﹑前列腺癌等常見腫瘤相關的microRNA(Oncomir)。更為重要的是,這些癌癥相關的microRNA都在血清樣品中經過了嚴格的測試,證明了其在血清中的穩定存在,因此非常適合于分子標志物的篩選。

    *圖釋:血清microRNA是重要的癌癥診斷分子標記物


  • microRNA作為分子生物學標記物的優勢

    ● 在血清/血漿,FFPE等臨床樣品中高度穩定

    ● miRNA表達的呈現出高度的組織/疾病特異性

    ● 單個miRNA往往可以調控數以百計的靶基因,因此只需通過少量的miRNA分子標志物就可相對準確的對疾病進行診斷和預后判斷

    ● miRNA是重要的調控分子,不僅可以用作診斷(diagnosis)和預后(prognosis)標志物還可以作為治療靶點


    1. 最優的覆蓋——對癌癥相關的microRNA最全面,最及時的收集

           Arraystar實時的關注各種權威的文獻和數據庫,并通過嚴謹的篩選流程從中收集癌癥關系最密切的microRNA。miRStar? 癌癥特異性microRNA PCR芯片是市場上對癌癥相關的microRNA覆蓋最全面、更新最及時、最合理的PCR芯片產品(見下表)。

    癌癥類型

    miRNA數目

    乳腺癌

    157

    胃癌

    97

    肺癌

    156

    肝癌

    113

    卵巢癌

    123

    結直腸癌

    130

    胰腺癌

    139

    前列腺癌

    140

    *圖釋:miRStar?癌癥特異性 microRNA PCR芯片覆蓋的與特定癌癥相關的microRNA數目。


    2. 驗證過的性能——芯片上的所有microRNA引物都在血清樣品中驗證過

           miRStar? 癌癥特異性microRNA PCR芯片上每條microRNA引物都經過了精心的設計,并且在血清血漿樣品中進行了驗證(見下圖)。預驗證的結果既確保了芯片的可靠性,又證實了這些癌癥相關的microRNA在血清血漿中的穩定性,進一步預示了其作為癌癥分子標志物的可能性。

    *圖釋:在血清樣品中,使用miRStar? 預驗證的 hsa-miR-142-3p特異性PCR引物的實時定量PCR擴增曲線(A)和熔解曲線(B)。溶解曲線呈現銳利的單峰,表明了反應具有很高的特異性。


    3. 同時檢測兩個樣品——樣品間技術誤差可以忽略不計

           miRStar?癌癥特異性 microRNA PCR芯片可以在同一塊PCR板上同時檢測2個樣品,如癌癥樣品 vs 正常樣品或是兩個生物學重復,樣品間的技術誤差幾乎可以忽略不計。


    4. miRStar?癌癥特異性microRNA & 靶基因芯片——同時檢測microRNA和靶基因,microRNA功能解析利器

           microRNA可以通過堿基互補的方式和靶標mRNA結合,而后降解mRNA沉默基因的表達。一個microRNA 可以調控近百個不同的mRNA分子,另一方面,一個mRNA也能夠結合多個不同的microRNA. 由此形成microRNA-靶基因網絡調控關系。在癌癥研究領域中,microRNA已經成為一個非常重要的部分。不同類型癌癥樣品具有不同的基因表達模式,因此,即使是相同的microRNA,它們在不同類型的癌癥樣品中的調控的靶基因往往是不同的。

           傳統的microRNA檢測平臺只檢測microRNA的表達狀況,不能平行的檢測microRNA和靶基因,從而無法全面的了解microRNA-靶基因調控網絡。

           Arraystar公司開創性的設計了miRStar?microRNA PCR芯片系統,可以同時檢測癌癥相關的microRNA和它們的靶基因。它不僅能夠快速檢測樣品中癌癥相關的microRNA的表達變化,還可以評估這些microRNA對靶標mRNA的調控活性,從而幫助研究者篩選到疾病中最為核心的功能microRNA分子,并迅速了解其調控機制和功能。

    同時檢測癌癥相關的microRNA和靶基因

           miRStar?癌癥特異性microRNA & 靶基因 PCR芯片包含癌癥相關的184個microRNA以及這些microRNA的178個靶標mRNA分子。184個microRNA是從最新的文獻中精心篩選,涵蓋了與胃癌,肝癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,結直腸癌,胰腺癌,前列腺癌等常見腫瘤相關的microRNA(見下表)。178個靶mRNA有大量的文獻支持,其表達水平的變化與腫瘤中microRNA的功能活性改變有關。通過創新性的實驗設計(見下圖),miRStar?癌癥特異性microRNA & 靶基因 PCR芯片實現了對microRNA和 靶mRNA的同時檢測,采用高效,優化的實驗流程,起始RNA量可低至50ng。

    *圖釋:miRStar?癌癥特異性microRNA & 靶基因 PCR芯片包含的microRNA(黃色背景),mRNA(紫色背景)和內參(紅色方框。

    *圖釋:miRStar?癌癥特異性microRNA & 靶基因PCR芯片工作流程。




  • 1.樣品RNA抽提

           a.實驗對象為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,使用BioPulverizerTM冰凍粉碎組織,加1ml的RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen),使用Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。

           b.實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細胞,加1ml的RNA抽提試劑TRIzol(樣品為貼壁細胞,每10cm2培養皿TRIzol使用量為1ml),裂解后抽提RNA。

    2.DNase I消化RNA樣品

           DNase I在37°C溫育處理RNA樣品,去除RNA抽提過程中可能混入的基因組DNA。

    3.RNA純化

           RNeasy MinElute純化試劑盒(Qiagen)對DNase I處理的RNA樣品純化回收,以得到單純的RNA樣本。

    4.RNA質量檢測

           a.使用Nanodrop測定RNA在分光光度計260nm、280nm和230nm的吸收值,以計算濃度并評估純度。

           b.用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度及完整性。

           c.提供RNA QC報告。

    5.cDNA合成

           按照miRStarTM第一鏈cDNA合成試劑盒使用說明將樣品RNA逆轉錄為cDNA (oligo dT和miRStarTM microRNA反轉引物)。

    6.實時定量PCR

           按照芯片說明將cDNA模板適當稀釋后加入到實時定量PCR反應混合液中,然后在含有基因特異性引物的384孔板各孔中加入等量反應液,進行實時定量PCR反應。

    7.數據分析

           利用配套軟件計算PCR芯片中的各個基因的Ct值,采用公認的ΔΔCt方法比較基因的表達變化。

           a.計算每個處理組中的每個microRNA和靶基因的ΔCt(microRNA和靶基因分別用各自的內參基因)。

           ΔCt (Ctrl) = average Ct - average of HK genes’Ct for Ctrl array

           ΔCt (Exp) = average Ct - average of HK genes’Ct for Exp array

           b.計算2個PCR Array中每個基因的ΔΔCt。

           ΔΔCt = ΔCt (Exp) - ΔCt (Ctrl)

           c.通過2-ΔΔCt計算Exp(實驗組)與Ctrl(對照組)間基因的表達差異。

    8.提供實驗報告

           Gene table(PCR板所含的基因列表)

           Excel芯片結果匯總表(包括芯片原始結果、數據分析和各種圖表)



  • Aksomics microRNA PCR芯片數據分析

    1.差異microRNA篩選

           microRNA的qPCR數據展示在“microRNA expression data”數據表格中,表達有差異(>2倍)或有顯著性(P<0.05)的數據用有顏色的字體標注,客戶可以很方便的根據自身要求,利用倍數變化和P值在列表中篩選差異microRNA,常用篩選標準:倍數變化>2倍,P<0.05。

    *圖釋:差異microRNA篩選示例


    2. 差異mRNA篩選 (僅適用于miRStar?癌癥特異性 microRNA & 靶基因芯片)

           靶mRNA的qPCR數據展示在“mRNA expression data”數據表格中,表達有差異(>2倍)或有顯著性(P<0.05)的數據用有顏色的字體標注,客戶可以很方便的根據自身要求,利用倍數變化和P值在列表中篩選差異microRNA,常用篩選標準:倍數變化>2倍,P<0.05。

    *圖釋:差異mRNA篩選示例 


    3. 差異microRNA與靶mRNA的聯合分析 (僅適用于miRStar?癌癥特異性 microRNA & 靶基因芯片)

            我們還將差異表達的microRNA(一般篩選標準為:倍數變化>=2倍,P<0.05)與其靶mRNA的表達數據進行整合,相應的數據展示在“microRNA-mRNA data”數據表格中。如果microRNA的靶基因與其表達趨勢相反,并且也在樣品組間呈現出顯著性的差異,那么在此類樣品中這個靶基因可能是此microRNA真實的靶基因。microRNA與靶mRNA的作用位點,可能的細胞學功能,以及相應的實驗證據來源也列在表格中。

    *圖釋: 差異microRNA和靶mRNA的聯合分析示例


    4. 散點圖
           客戶可以根據散點圖直觀的看到表達上下調的基因,及其上下調程度


    *圖釋:散點圖示例。位于灰色條帶上方的是上調倍數大于2倍的microRNA/mRNA,位于灰色條帶下方的是下調倍數大于2倍的microRNA/mRNA

    5. 3D圖
           可以直觀的了解表達上下調的基因,及其在PCR板上的位置


    *圖釋:3D圖示例。縱軸為基因表達倍數變化,橫縱軸分別代表相應基因在PCR板上的位置。