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RNA-蛋白相互作用

  • 簡介
  • 技術原理
  • 案例展示
  •        作為基因組DNA的直接產物,RNA對生命活動有著至關重要的意義,是生命活動的又一執行者:1、參與蛋白質的合成;2、參與轉錄后修飾和DNA修復;3、參與基因表達調控等。對于一種特定的RNA(如,lncRNA,mRNA,circRNA,microRNA,tRF&tiRNAs等),往往具有與之對應的相互作用蛋白共同執行特定的生理功能,以lncRNA為例,近年來,lncRNAs在基因表達調控方面的重要功能越來越被人們所關注,但它們的具體功能還有待闡明。LncRNA可能通過4種作用機制參與基因調控:Decoy,作為誘餌分子,替代蛋白與DNA的相互作用;Scaffold,作為骨架分子,為蛋白復合體提供空間支撐作用;Guide,作為引導分子,介導蛋白-蛋白、蛋白DNA/RNA相互識別;Enhancer,作為增強子類似組件,促進基因表達[1] 。運用RNA親和純化技術(eg. ChIRP-MS,RAP-MS[2]),構建特定RNA相互作用蛋白譜,對闡明RNA的生理病理機制至關重要。

                圖1. lncRNA作用機制模型。


    參考文獻 

    1.Rinn, J. L. & Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annual review of biochemistry 81, 145-166, doi:10.1146/annurev-biochem-051410-092902 (2012). [PMID: 22663078].
    2.McHugh, C. A. et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature 521, 232-236, doi:10.1038/nature14443 (2015). [PMID: 25915022].




  • 根據目標RNA的尺寸大小,可采用兩種相似的技術策略:
           長鏈RNA:例如,lncRNA、circRNA、mRNA等常采用RNA Antisense Purification – Mass Spectrometry策略。生物樣品在非變性條件下裂解和UV交聯,或者不裂解直接在原位進行UV交聯,隨后用biotin標記的RNA anti-sense進行雜交(Control組采用非特異anti-sense或預先用RNase處理)。
           短鏈RNA:例如,micoRNA、tRF&tiRNA等通常采用RNA Affinity Purification – Mass Spectrometry策略。體外合成biotin標記的目標RNA(Control組采用scramble RNA),加入到非變性裂解的生物樣品中,孵育替換內源的RNA。

           隨后,通過固定化avidin對biotin進行pull-down,得到的RBP經LC-MS/MS鑒定和定量分析,與目標RNA特異性相互作用的蛋白(A, B, C, D)在兩組間具有顯著差異,非特異相互作用蛋白(X)在兩組間比例接近1:1。據此構建目標RNA的相互作用蛋白譜。


    圖2.RAP-MS技術原理和實驗流程。



  • 案例展示1

           運用ChIRP-MS技術 (和RAP-MS技術原理相同的技術,a),Stanford大學的科研人員對Xist RNA的相互作用蛋白譜進行了研究,發現81種Xist RNA相互作用蛋白,對Xist的功能行使具有重要意義。[3]
           首先,為了對ChiRP-MS方法進行驗證,作者選擇了兩種已知的snRNA,U1/U2(參與剪接體的組裝)進行驗證實驗。U1/U2具有很高的表達量,同時,剪接體的組分研究得較為清楚,另外,U1/U2在抑制未成熟mRNA的剪接和poly-A化方面的作用已見報道,預示著更多未知的相互作用蛋白可能被鑒定到,因此U1/U2很適用于ChIRP-MS方法驗證。針對U1/U2設計anti-sense RNA進行ChIRP-MS實驗,結果如下:U1和U2分別富集了418和370個蛋白,其中113個已知的剪接體蛋白(共143個)(c)。


           相互作用網絡圖進一步展示了U1/U2互作蛋白富集情況:位于上部的為已知蛋白,主要為剪接體蛋白,位于下方的為功能未知蛋白,包括只與U1或U2互作的蛋白以及和兩者共同作用的蛋白。ChIRP-MS技術不僅能夠很好的鑒定已知的RNA互作蛋白,同時也能鑒定未知蛋白,是研究RNA-protein相互作用的強大工具。

                         



    案例展示2 

           在多種應激條件下,tRNA能夠發生特異性酶切,產生一類功能獨特的tRNA片段(tRFs),和許多生理病理過程密切相關。來自Rockefeller University的科學家通過高通量測序技術發現一類tRFs特異性高表達于高轉移性乳腺癌細胞中,并具有特定的motif,據此推測,細胞中可能存在某些與之特異性識別的蛋白質。為了鑒定這些未知的相互作用蛋白,作者運用RNA親和純化技術,用biotin標記的tRFs片段進行pull down(短鏈RNA RAP-MS技術),結合LC-MS/MS鑒定和定量分析,發現一個潛在的結合蛋白YBX1,并進行了深入研究。結果表明,YBX1蛋白能夠與腫瘤轉移相關基因mRNA結合并穩定mRNA,而tRFs可與mRNA競爭性結合YBX1,進而使腫瘤轉移相關的mRNA去穩定性,抑制腫瘤的轉移性。[4]