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hMeDIP-qPCR

  • 簡介
  • 技術難點
  • 技術服務流程
  •        實時熒光定量PCR技術(Real-time Quantitative PCR)是在PCR反應體系當中加入熒光試劑,利用熒光信號積累實時檢測PCR的進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一,靈敏,快速,高重復地精確定量起始模板的濃度。
           Aksomics(原康成生物)將實時定量PCR技術與hMeDIP技術完美結合。首先通過hMeDIP技術富集甲基化的DNA片段,然后利用實時定量PCR技術進行檢測,最后經過數據分析處理得到檢測的生物樣品中特定位點的甲基化水平的精確數值。

  • ? 高特異性,針對感興趣的基因啟動子或CpG島設計實時定量PCR引物
    ? 超寬的線性范圍,可跨越7個數量級
    ? 精確度高,重復性好
    ? 靈敏度高 

  • A. 將基因組DNA 超聲打斷成400bp-500bp片段
    B. 加熱變性,并將變性后的單鏈DNA樣品分為兩份
    C. 其中一份單鏈DNA樣品加入抗5’-羥甲基胞嘧啶抗體,另一份作為Total input DNA樣品
    D. 使用親和層析分離C步樣品中的羥甲基化DNA片段的抗體復合物,樣品中其余的非羥甲基化DNA片段被洗脫。純化得到羥甲基化DNA片段(hMeDNA-IP DNA)
    E. 實時定量PCR檢測 


    數據處理

    ?  Total input DNA樣品作為模板,用待測基因特異性引物進行qPCR檢測得到Ct (input)
    ?  hMeDNA-IP DNA樣品作為模板進行檢測得到Ct (IP)
    ?  待測基因甲基化DNA免疫沉淀(hMeDIP)的效率(hMeDIP / Total input)可通過以下公式計算:
       %(hMeDIP / Total input)= 2^[ Ct (input)- Ct (IP) ] X 100