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客戶成果 |王紅陽院士課題組最新發表 CircRNA-CDYL在肝癌早期發揮特殊作用

東方肝膽外科醫院王紅陽院士團隊長期從事肝癌的基礎與臨床研究工作。近期,該團隊利用Arraystar Human circRNA 芯片、mRNA表達譜芯片和miRNA表達譜芯片對早期肝癌組織和鄰近正常組織的circRNA, mRNA和miRNA進行了全面的差異表達分析。研究發現,CircRNA-CDYL(以下稱circ-CDYL)在肝癌早期表達水平顯著上調,可促進EPCAM陽性的肝癌起始細胞比例上升。Circ-CDYL 通過吸附miR-892a和miR-328-3p,調節肝癌來源生長因子HDGF和缺氧誘導因子天冬酰胺羥化酶HIF1AN的表達,形成了以Circ-CDYL為核心的ceRNA調控網絡。進一步的機制研究發現, HDGF下游的PI3K-AKT-mTORC1/β-catenin信號通路和HIF1AN下游的NOTCH2信號通路被調節,導致致癌蛋白MYC和SURVIVIN表達上調,從而促進了早期肝癌的發生發展進程。干擾Circ-CDYL表達,同時聯合使用靶向PI3K 和HIF1AN分子的抑制劑wortmannin和NOD,可高效抑制肝癌細胞的生長。臨床樣本分析發現,Circ-CDYL或Circ-CDYL聯合HDGF和HIF1AN,均可作為區分早期肝癌的獨立標志物。該研究發表在肝臟病學領域權威期刊HepatologyIF:14.079)上(circRNA, mRNA與miRNA芯片實驗均由康成生物提供技術服務)。


研究背景

肝癌是一類病情發展迅速的惡性腫瘤,近年來發生率和死亡率不斷攀升。由于缺乏有效的早期診斷標志物和治療靶點,許多患者不能被及時發現和治療,三分之二的肝癌患者確診時已處于中晚期。因此,尋找特異性的診斷標志物和治療靶點顯得十分迫切和必要。目前大部分肝癌研究都集中在肝癌的中晚期階段,而對肝癌早期的情況知之甚少。

越來越多的證據表明,非編碼RNA在人體中具有廣泛的生理病理作用。circRNA是一類異常穩定的非編碼RNA分子,其已知的功能包括吸附miRNA或蛋白,調節轉錄和剪接過程,以及翻譯短肽,是一種極具潛力的分子標志物和治療靶點。然而,目前大多數circRNA的分子和生物學功能處于未知狀態。


研究思路

作者首先通過Arraystar Human circRNA芯片、Agilent全基因表達譜芯片、Exiqon human microRNA 芯片分析了早期肝癌組織和鄰近正常組織的circRNA,mRNA 和miRNA表達譜,發現有92個circRNA表達上調,85個circRNA表達下調;9470個mRNA表達上調,10765個mRNA表達下調;310個miRNA表達上調,142個miRNA表達下調。為了進一步研究circRNA,miRNA和mRNA之間的相互作用,作者進行了RNA互作網絡分析,并基于ceRNA調控特點,依據三個標準進行了篩選:1)候選circRNA和mRNA具有共同的miRNA作用元件(MRE);2)候選circRNA和mRNA在肝癌組織和正常組織中的變化趨勢一致;3)排除由差異表達miRNA所介導的互作網絡。篩選得到了126個共同上調的circRNA-mRNA對和74個共同下調的circRNA-mRNA對。作者最終挑選了在早期肝癌組織中上調最顯著的Circ-CDYL進行下一步研究,Circ-CDYL 通過吸附miR-892a和miR-328-3p,調控肝癌來源生長因子HDGF和缺氧誘導因子天冬酰胺羥化酶HIF1AN的表達。隨后作者使用qRT-PCR技術對Circ-CDYL、HDGF和HIF1AN在肝癌早期組織(0和A期)和肝癌晚期組織(B和C期)進行了驗證,結果與芯片結果一致。一代測序結果證實了Circ-CDYL來源于基因CDYL的2號外顯子,核質分離實驗則表明Circ-CDYL在細胞核和細胞漿中均有表達,但主要位于細胞漿中,提示Circ-CDYL可能作為ceRNA發揮功能。

接下來作者對Circ-CDYL的生理功能進行了探索,體外敲低和過表達實驗表明,Circ-CDYL可促進癌癥細胞增殖(CCK8細胞增殖實驗),提升肝癌啟動細胞(T-ICs)和EPCAM+ T-ICs細胞的比例(FACS),促進腫瘤成球生長(腫瘤成球實驗),增強癌細胞對化療藥的耐受性(FACS檢測細胞凋亡)和癌癥細胞在小鼠體內的成瘤能力(小鼠腫瘤移植模型)。

然后,作者對Circ-CDYL的作用機制進行了探討。lucifearse報告基因實驗、miRNA pull-down實驗、結合位點阻斷實驗證實HDGF和HIF1AN的3’UTR區分別含有miR-892a作用元件和miR-328-3p作用元件,然而miRNA和靶向mRNA之間不存在負相關關系。相反,Pearson相關性分析、Circ-CDYL敲低和過表達實驗、HDGF和HIF1AN干擾實驗、FISH共定位實驗、結合位點阻斷實驗結果表明,Circ-CDYL通過ceRNA機制調控HDGF和HIF1AN的表達,該機制依賴于miR-892a和miR-328-3p。進一步的下游信號通路研究顯示,Circ-CDYL上調HDGF 和HIF1AN表達,分別激活PI3K-AKT-mTORC1/β-catenin信號通路和抑制HIF1AN下游的NOTCH2信號通路,增強了致癌蛋白MYC和SURVIVIN表達,從而促進早期肝癌的發生發展。

最后,作者探索了Circ-CDYL在肝癌臨床治療和診斷上的潛在應用價值。使用PI3K抑制劑wortmannin或者HIF1AN抑制劑NOD處理,可以阻斷由Circ-CDYL引起的MYC和SURVIVIN表達上調,而且兩種抑制劑聯合使用效果最佳。并且,如果在使用兩種抑制劑的同時,干擾Circ-CDY表達,可以最大程度的抑制MYC和SURVIVIN表達,有效降低EPCAM+ T-ICs 的比例,實現對肝癌細胞生長和增殖的最佳抑制效果。在肝癌早期診斷方面,ROC分析顯示,Circ-CDYL、HDGF或HIF1AN三個分子分別呈現出良好的靈敏度和特異性,而且三種分子聯用效果最佳,其靈敏性高達75.36%和特異性高達66.67%。


技術路線

結果展示

圖1. Arraystar Human circRNA芯片、mRNA表達譜芯片和miRNA表達譜芯片篩選出了一個在肝癌早期高表達的cirRNA Circ-CDYL以及由Circ-CDYL驅動的ceRNA網絡, 并通過qRT-PCR和一代測序進行了表達和序列驗證。

圖2. Circ-CDYL的功能試驗結果。Circ-CDYL可促進癌癥細胞增殖(A),提升肝癌啟動細胞(T-ICs)和EPCAM+ T-ICs細胞的比例(B和E),促進腫瘤成球生長(C),增強癌細胞對化療藥的耐受性(D)和癌癥細胞在小鼠體內的成瘤能力(F)。

圖3. 干擾Circ-CDYL表達,同時聯合使用靶向PI3K 和HIF1AN分子的抑制劑wortmannin和NOD,具有抑制肝癌細胞生長的最佳效果。

圖4.  Circ-CDYL 聯合 HDGF、HIF1AN分子在早期肝癌診斷上具有極高的靈敏度和特異性。


研究意義

本研究通過Arraystar Human circRNA芯片、mRNA表達譜芯片和miRNA表達譜芯片篩選出了一個在肝癌早期高表達的cirRNA Circ-CDYL以及由Circ-CDYL驅動的ceRNA網絡。Circ-CDYL 通過吸附miR-892a和miR-328-3p,促進肝癌來源生長因子HDGF和缺氧誘導因子天冬酰胺羥化酶HIF1AN的表達,激活HDGF下游的PI3K-AKT-mTORC1/β-catenin信號通路和抑制HIF1AN下游的NOTCH2信號通路,上調致癌蛋白MYC和SURVIVIN,從而促進早期肝癌的發生發展進程。重要的是,本研究在肝癌早期診斷和治療上提供了極有價值的線索。干擾Circ-CDYL表達,同時聯合使用靶向PI3K 和HIF1AN分子的抑制劑wortmannin和NOD,可高效抑制肝癌細胞的生長。Circ-CDYL、HDGF和HIF1AN三分子聯用在診斷早期肝癌上呈現出了極高的靈敏度和特異性。

通訊作者介紹

本文的通訊作者是東方肝膽外科醫院、國家肝癌科學中心王紅陽教授。王紅陽教授是我國腫瘤學、分子生物學著名專家,是教育部長江特聘教授、中國工程院院士。現任國家肝癌科學中心主任、國際合作生物信號轉導研究中心主任。中國抗癌協會副理事長,中國醫師協會精準醫學專業委員會主任委員。王紅陽教授長期從事腫瘤的基礎與臨床研究,對腫瘤的信號網絡調控、肝癌新分子標志物鑒定及應用等有重要建樹。在國際有影響的主流期刊發表論文200余篇;近五年申報發明專利28項,已獲授權12項(國際專利2項),主持研發的Glypican-3肝癌檢測診斷試劑盒獲得國家食品藥品監督管理總局(CFDA)頒發的三類醫療器械注冊證(是我國第一個以具有完全自主產權的單克隆抗體為基礎研發獲批的試劑盒)。

李亮副研究員為本文共同通訊作者,第一作者是課題組危晏平碩士。在王紅陽院士的帶領下,該課題組長期關注早期肝癌的診斷及非編碼RNA調控,相關系列研究成果發表在Gut, Hepatology, Cancer letters,Faseb journal等期刊上。


原文鏈接

A Noncoding Regulatory RNAs Network Driven by Circ‐CDYL Acts Specifically in the Early Stages Hepatocellular Carcinoma