三分排列3

客戶成果丨lncRNA GMAN通過影響基因翻譯進而調控胃癌轉移

浙江大學基礎醫學院周天華教授長期從事細胞運動和細胞周期的分子調控及其在胃癌發生發展中的作用的研究。近期,該課題組應用Arraystar lncRNA芯片分析了胃癌組織和癌旁組織中lncRNAs的差異表達情況,發現lncRNA GMAN在胃癌組織中表達顯著上調,并通過促進基因EFNA1的翻譯來調控腫瘤的發生和發展。本研究為抑制胃癌的轉移提供了新的治療策略和潛在靶點。研究成果于2018年發表在國際著名學術期刊Gastroenterology (IF:20.773)上。(芯片實驗由康成生物提供技術服務)


研究背景

      胃癌(GC)是全世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一。并且,約40%的胃癌患者同時伴隨有癌轉移,其中95%的癌轉移患者生存期不超過5年。由于對胃癌轉移的生物學過程及其分子機制知之甚少,因此目前還缺乏針對胃癌轉移的有效治療手段。所以,闡明胃癌轉移的分子機制對于尋找有效的胃癌治療手段具有重要作用。

      轉錄組學研究顯示70%的基因組可以轉錄成RNA,其中大多數都是非編碼RNA(lncRNA、circRNA、tRF和miRNA等)。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度在200nt以上的非編碼RNA,多項研究結果表明lncRNA的異常表達和癌癥的發生發展密不可分,但是lncRNA影響胃癌發生和轉移分子機制仍是未知。

      本文的研究目的篩選胃癌表達差異顯著的lncRNA,并詳細闡述lncRNA和胃癌轉移之間的調控關系。


研究思路

      作者首先選取了6個胃癌患者的癌組織和癌旁組織,通過Arraystar lncRNA芯片篩選差異表達的lncRNA。總共篩選到151個上調和69個下調的lncRNAs。接著,根據上調的151個指標的韋恩分析結果挑選了4個lncRNAs繼續擴大樣本驗證(n=112),驗證結果顯示lncRNA GMAN在胃癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織。然后,作者借助RACE、FISH、蛋白編碼潛力預測和Northern Blot等實驗對lncRNA GMAN的分子特征進行探究,發現GMAN是由基因EFNA1的intron 2和3區域轉錄出來的一條長度是855nt的lncRNA,并且它主要定位在細胞質中。

      為了探究GMAN和胃癌以及癌轉移的臨床相關性,作者選取了兩組樣本(n=40和n=186)進行臨床生存分析,K-M生存曲線顯示GMAN高表達的患者生存期都比較短。而且與未發生癌轉移患者的胃癌組織相比,癌轉移患者的胃癌組織中lncRNA GMAN的表達水平顯著上調。并且,TCGA數據庫的大樣本分析結果也證實了這個結果。

      接下來,作者選取了胃癌細胞系BGC-823和HGC-27做GMAN的功能實驗,過表達和干擾實驗表明GMAN主要促進胃癌細胞的侵襲,但是不影響胃癌細胞的增殖。此外,體內實驗也證實了GMAN可以促進癌細胞的肺轉移。

考慮到GMAN是基因EFNA1的內含子區域轉錄出來,所以作者猜測GMAN是否調控EFNA1的表達。Northern blot和多聚核糖體結合實驗表明GMAN不影響EFNA1的轉錄,而是促進EFNA1的翻譯。前期已有文獻報道EFNA1和腫瘤發生有關,作者在本研究中也證實EFNA1可以促進胃癌細胞的侵襲,但是不影響細胞增殖。因此,就鎖定了GMAN下游調控的潛在靶點是基因EFNA1。

      lncRNA GMAN又是如何調控EFNA1的翻譯效率?作者繼續做了深入的機制分析,發現基因EFNA1區域除了可以轉錄GMAN以外,還可以轉錄出來一條長度是2311nt的lncRNA GMAN-AS,并且GMAN-AS的序列和GMAN或EFNA1是部分互補。然后,作者通過一系列的截短實驗證實lncRNA GMAN-AS和基因EFNA1的mRNA序列結合,從而抑制EFNA1的翻譯和癌細胞的侵襲;而GMAN又可以競爭性結合GMAN-AS,來抑制GMAN-AS和EFNA1的結合,最終促進EFNA1的翻譯和癌細胞的侵襲。

      作者發現,臨床胃癌組織中GMAN和GMAN-AS這兩種lncRNA的比例與ephrin A1蛋白水平正相關。轉移性胃癌病人組織中該比例較高,并且患者具有較短的生存時間。同時,作者借助CRISPR/Cas9技術靶向編輯GMAN,結果顯示GMAN靶向處理組可以顯著抑制癌細胞的肺轉移,從而提高小鼠的生存時間。

      綜上所述,作者發現胃癌組織中GMAN和GMAN-AS這兩種lncRNA的比例正向調控EFNA1的翻譯效率和癌轉移,同時也揭示了lncRNA調控基因轉錄后調控的新模式。此外,基于CRISPR/Cas9的研究結果為抑制胃癌的轉移提供了潛在治療靶點。


技術路線



結果展示


圖1 芯片結果展示及擴大樣本驗證

圖2 lncRNA GMAN的臨床相關性分析結果

圖3 lncRNA GMAN促進胃癌細胞的侵襲(體內實驗和體外實驗)

圖4 lncRNA GMAN通過調控基因EFNA1的翻譯效率促進胃癌轉移


研究意義

      該課題組借助Arraystar Human lncRNA 芯片篩選胃癌組織中異常表達的lncRNA。并經過進一步擴大樣本驗證和臨床相關性分析發現lncRNA GMAN高表達的胃癌患者通常具有較短的生存期。體內和體外功能實驗顯示lncRNA GMAN主要是促進胃癌細胞的侵襲,而深入的機制實驗證實GMAN是通過促進基因EFNA1的翻譯進而調控胃癌的轉移。該研究揭示了lncRNA調控基因表達的新模式,也為研究胃癌的癌轉移和治療提供了新的線索。


原文出處

Long Noncoding RNA GMAN, Up-regulated in Gastric Cancer Tissues, Is Associated With Metastasis in Patients and Promotes Translation of Ephrin A1 by Competitively Binding GMAN-AS.